transkription af RelB-genet reguleres af NF-kB

NF-kB inducerende stimuli opregulerer transkriptionen og syntesen af RelB

vi undersøgte først, om stimuli, der vides at udløse NF-kB-translokation, ville inducere translokationen af RelB til kernen. Til dette blev tilstedeværelsen og niveauerne af de forskellige NF-kB-proteiner og niveauerne af prototypen NF-kB-hæmmer, IkBa analyseret i både nukleare og cytosoliske ekstrakter af den promonocytiske cellelinie U937 efter TNF-behandling. Mens RelA-og p50-nukleare niveauer steg hurtigt efter TNFa-behandling (inden for 30 min), og dette blev ledsaget af et fald i IkBa i det cytosoliske rum, forekom RelB ikke i kernen selv ved 2 timer efter TNF-behandling (Figur 1). Disse resultater antyder, at RelB-nuklear translokation og dens regulering ikke er parallel med RelA.

Figur 1

TNF resulterer ikke i RelB-translokation til kernen. U937-celler blev behandlet med TNF (10 ng/ml), og nukleare og cytosoliske ekstrakter blev høstet på forskellige tidspunkter efter stimulering. Tyve liter proteinekstrakter / bane blev analyseret af SDS-PAGE og immunoblottet med forskellige antistoffer som angivet

tidligere undersøgelser har antydet, at RelB-niveauer stiger inden for timer efter cellestimulering ved stimuli, der vides at aktivere NF-kB, såsom LPS eller CD40-ligering (Neumann et al., 1996). Baseret på dette stillede vi spørgsmålstegn ved, om den forventede stigning i det samlede RelB-proteinniveau i cellen ville korrelere med de novo-translokation til kernen. Som vist i figur 2a resulterede lipopolysacharid (LPS)-behandling af B-cellelinjen BJAB (venstre panel) eller behandling af den promonocytiske cellelinje U937 med TNF-eller phorbelestere (PMA) i 6 timer (højre panel) i en langsom, men progressiv stigning i steady-state-niveauet af RelB-protein, men ikke RelA (data ikke vist). Vi undersøgte derefter i BJAB-celler, om stigningen i steady state-niveauerne af RelB efter langvarig LPS-stimulering korrelerede med dens nukleare translokation. Som vist i figur 2b (venstre panel) er stigningen af RelB i cytosolen efter LPS-behandling parallel med en stigning af denne transkriptionsfaktor i det nukleare rum.

figur 2

stigningen i RelB-proteinniveauer efter timers aktivering med forskellige stimuli er følsom over for Actinomycin D. (a) BJAB-celler blev behandlet med LPS (larg/ml) i de angivne timer. Ligeledes blev u937-celler behandlet med TNF (10 ng/ml) eller PMA (20 ng/ml) i 6 timer. samlede cellelysater (2 liter) blev analyseret i SDS–side og immunoblotted ved anvendelse af anti-RelB eller anti-Purpur-actinantistoffer. Densitometri blev udført, og foldforøgelsen i RelB-koncentration som en funktion af koncentrationen af urin-actin er indikeret. B) BJAB-celler blev inkuberet i 16 timer med eller uden LP ‘ er (5 liter/ml) og med eller uden Actinomycin D (1 liter/ml). Ligeledes blev u937-celler behandlet eller ej med TNFa (10 ng/ml) og Actinomycin D (1 kg/ml) i 16 timer. proteinekstrakter (20 kg/bane) blev analyseret af SDS–PAGE og immunoblottet som angivet. Densitometri blev udført, og foldforøgelsen i RelB-koncentration i forhold til kurr-actin er indikeret. N. S.= ikke specifikt bånd

vi begrundede derefter, at hvis stigningen i cytosolisk RelB efter celleaktivering ved stimuli såsom LPS eller TNF er sekundær til transkription, inhibering af gentranskription bør mindske RelB-stigninger i cytosolen og dermed dens tilstedeværelse i det nukleare rum. For at studere dette blev BJAB-celler stimuleret i 16 timer med LPS (figur 2b, venstre panel) eller u937-celler stimuleret i 6 timer med TNFa (figur 2b, højre panel) behandlet eller ej med Actinomycin d, en hæmmer af gentranskription. Som vist i figur 2b blokerede Actinomycin selektivt stigningen i total RelB efter LPS-behandling af BJAB-celler eller TNF-behandling af U937-celler.

på baggrund af ovenstående konkluderes det, at RelB-proteinniveauer reguleres af transkriptionelt afhængige mekanismer, og at stimuli såsom TNF og LPS, der vides at inducere den hurtige (transkriptionelt uafhængige) nukleare translokation af RelA, er involveret i regulering af RelB-transkription og syntese, som i sidste ende korrelerer med dens nukleare translokation på senere tidspunkter end dem, der kræves til RelA.

RelB-transkription er RelA-afhængig

baseret på ovenstående observationer stillede vi spørgsmålstegn ved, om RelB-transkription til en vis grad reguleres af RelA. For at imødegå denne hypotese undersøgte vi, om steady state RNA-niveauerne af RelB blev øget efter celleaktivering ved stimuli, der vides at inducere den nukleare translokation af RelA. Både LPS-behandling af BJAB (figur 3a, venstre panel) eller TNF-eller PMA-behandling af u937 vægtceller (figur 3a, midterste panel) inducerede signifikante stigninger i steady state-niveauerne af RelB mRNA. Brug af u937-cellelinjen, der overudtrykt en negativ dominerende isoform af IkBa, og som tidligere er blevet karakteriseret og beskrevet af vores laboratorium (Asin et al., 1999), testede vi enten TNF eller PMA ‘ s evne til at øge RelB RNA-niveauer. Som vist i figur 3a (højre panel) resulterede både TNF og PMA i signifikant lavere RelB RNA-niveauer i u937-klonen, der udtrykte den negative dominerende IkBa (U937 32A/36A) end i kontrol-u937-klonen (U937 vægt). Dette antyder, at IkBa er involveret i regulering af transkriptionen af RelB, formodentlig via RelA.

figur 3

RelA øger RelB transskription og proteinekspression. BJAB-celler eller u937 vildtypeceller (vægt), der udtrykker tom vektor, eller en vektor, der udtrykker IkBa 32/32A (U937 32A/36A) blev behandlet med enten LP ‘ er (5 liter/ml) i tilfælde af BJAB eller TNF (10 ng/ml) og PMA (20 ng/ml) i 6 timer i tilfælde af u937-celler. Total RNA (10 kg) blev ekstraheret og underkastet hybridisering med en human RelB cDNA eller human GAPDH probe. (B) musembryonale fibroblaster af heterosygøse RelA – mus (MEF RelA+/−) eller homosygøse RelA – mus (MEF RelA−/−) blev behandlet med eller uden TNF (10 ng/ml) i 4 timer. MEF ( − / − ) celler blev også transficeret med Tom vektor (ikke vist) eller vektor indeholdende kodningssekvensen for RelA og høstet 24 timer senere. Total RNA (1 liter) blev analyseret ved Northern blot hybridisering med mus RelB cDNA eller GAPDH DNA 32P-mærkede prober. (C) MEF (RelA−/−) celler blev transficeret med vektorkontrol (vektor) eller en ekspressionsvektor, der koder for det humane RelA cDNA. Kerneekstrakter (4 liter) eller cytosoliske ekstrakter (1 liter) blev isoleret og analyseret af SDS-PAGE og immunoblottet som angivet

for yderligere at undersøge denne mulighed studerede vi reguleringen af RelB i murine embryonale fibroblaster (MEF) afledt af RelA−/− knockout-musen. TNF stimulering af MEF heterosygøs til RelA deletion (MEF RelA+/−) resulterede i en stigning i RelB RNA niveauer (figur 3b, venstre panel). Tværtimod øgede TNF− stimulering af MEF− cellerne homosygøs til RelA-deletion (MEF RelA -/ -) ikke RelB RNA-niveauer (figur 3b, højre panel). Når MEF RelA – / – transient transficeres med en ekspressionsvektor af human RelA, observeres en stigning i RelB mRNA-niveauer. Disse data antyder, at RelB-regulering delvis er RelA-afhængig.

vi undersøgte derefter, om virkningerne af RelA på RelB mRNA-niveauer også resulterer i en stigning i RelB-proteinniveauer og potentielt dets nukleare translokation. MEF ‘ er fra RelA−/− mus blev transient transficeret med en RelA-ekspressionsvektor efterfulgt af analysen af nukleare og cytosoliske proteinniveauer. Som vist i figur 3c forårsager forbigående ekspression af RelA en stigning i RelB i det nukleare rum.

alt i alt argumenterer de hidtil præsenterede data for en stram regulering af RelB-transkription af RelA, som påvirker RelB-proteinsyntese og i sidste ende dens translokation til kernen.

kloning og sekvenskarakterisering af den 5′ utranslaterede genomiske region af human RelB

for formelt at karakterisere og demonstrere, om RelA-medieret opregulering af RelB mRNA medieres gennem direkte transaktivering af RelB-genpromotorregionen, forfulgte vi dens kloning og sekventering. Ved hjælp af en række teknikker beskrevet i afsnittet materiale og metoder blev en 1694 bp-sekvens opstrøms for translation initiation codon (ATG) klonet og sekventeret (figur 4a). 95 bp opstrøms for ATG efterfulgt opstrøms af formodede NF-kB DNA-bindende motiver. Derudover noteres CREB-og cEBP1-bindende cis-virkende sekvenser i hele denne 5′ – region. Et TATA-konsensusmotiv er fraværende. Flere transkriptionsinitieringssteder forventes at stamme fra den GC-rige region (figur 4a). Ved anvendelse af omvendte primerforlængelsesassays blev transkriptionsinitieringssteder fundet ved -114 og -126 i regionen forudsagt at binde RNA-polymerase (figur 4a).

figur 4

kloning og sekventering af den 5′ uoversatte region af human RelB. (a) ATG-boksen svarende til oversættelsesinitieringsstedet vises fremhævet med en pil i position+1. De to vigtigste transkriptionsinitieringssteder er angivet med en stjerne. Formodede cis-virkende bindingssteder for en række transkriptionsfaktorer fremhæves. (B) kloning af fuld længde eller 5′ – sletninger af den humane RelB-genpromotor i pGL3-basisekspressionsvektoren. De to formodede NF-kB-steder fremhæves, ligesom RNA-polymerasebindende region. Hver konstruktion er nummereret svarende til længden af dens sekvens (1,7, 1,1, 0,6 og 0.25 kb)

RelA og RelB regulerer direkte og uafhængigt RelB-promotorgentranskription

for at karakterisere, om denne 1694 bp-genregion giver basal eller inducerbar transkriptionsaktivitet, blev DNA ‘ et mellem -1694 og -31 (i forhold til ATG-kodonet), og som inkluderer de formodede transkriptionsinitieringssteder, klonet til en minimal promotor (pGL-3), der driver transkriptionen af firefly luciferase-genet. Desuden blev der lavet et antal 5’-trunkeringer af det formodede RelB-promotorregion-luciferase-ekspressionsgen (figur 4a).

for at bestemme, om den formodede RelB-promotor er funktionel, blev HeLa-celler transient transficeret med promotorgenet i fuld længde (heri benævnt 1,7 kb) eller 5′ sletninger klonet ind i PGL-3 basisk luciferase ekspressionsvektor (1,1 kb, 0,6 kb og 0,25 kb) efterfulgt eller ej af cellestimulering med enten TNF eller PMA. Som vist i figur 5a, en basal transkriptionsaktivitet af den formodede RelB-promotorforstærkerregion detekteres i 1.7 kb til 0,6 kb konstruktioner med et fald observeret i 0,25 kb konstruktionen. Desuden øgede TNF eller PMA transkriptionsaktiviteten af alle fire RelB-promotorgenkonstruktioner, der antyder, at TNF-eller PMA-responsive cis-virkende motiver er placeret inden for 0,25 kb-konstruktionen.

figur 5

NF-kB inducerende stimuli og RelA, c-Rel og RelB transkriberer promotor-enhancer-regionen af human RelB. (a) HeLa-celler blev transient transficeret med en NF-kB concatamer, der kørte ekspressionen af luciferase (kB luc) eller de forskellige humane promotorregioner af RelB (1,7 kb til 0,25 kb konstruktioner) plus et tk-luc (Renilla) plasmid til kontrol for transfektionseffektivitet. Atten timer efter transfektionsceller blev stimuleret eller ej med TNF (10 ng/ml) eller PMA (20 ng/ml) i 6 timer, hvorefter celler blev lyseret. Firefly luciferase produceret af kB luc eller RelB luc-konstruktionerne blev normaliseret til Renilla luciferase-aktiviteten genereret fra TK (thymidinkinase) – promotoren. Tallene oven på hver bjælke repræsenterer (fold) induktion over de ustimulerede prøver i hvert punkt. Standardafvigelser er angivet. (B) samme som i (a) bortset fra at 1.1 og .25 kb RelB luc-konstruktioner blev co-transfekteret med 2 liter P50 og RelA-eller RelB-eller c-Rel cDNA-ekspressionsvektorer som angivet. Kontrollerne blev behandlet med TNF eller PMA som i litra a). (c) HeLa-celler blev transficeret med 100 ng af 1,1 kb RelB-promotoren luciferase reporter-konstruktionen, 20 ng af en Renilla luciferase reporter-konstruktion under kontrol af en TK-promotor og 100 ng af RelA, RelB og/eller p50. Celler blev lyseret, og luciferaseaktivitet blev bestemt ved luminescens. Aflæsninger udtrykkes i relative luciferase enheder (RLU) svarende til ekspression af firefly luciferase normaliseret til den konstitutivt udtrykte Renilla luciferase

for at bestemme, om RelA øger transkriptionen af RelB-promotorgenet, blev konstruktioner 1,1 kb og 0,25 kb Co-transficeret med RelA/p50 cDNA til HeLa-celler. Som vist i figur 5b driver RelA/p50 effektivt transkriptionen af enten 1.1 kb eller 0.25 kb genkonstruktioner i samme grad som den, der observeres for enten TNF eller PMA. Når den samme analyse blev udført under anvendelse af RelB-og p52 cDNA-ekspressionsvektorer, demonstreres det, at RelB i forbindelse med p52 også er i stand til at drive RelB-promotor-transkriptionsaktivitet, omend i mindre grad end den, der blev observeret for RelA/p50. Endelig er det påvist, at C-Rel/p50 heterodimerer også kan drive ekspressionen af RelB promotor enhancer region, omend svagt (figur 5b).

for at bestemme, om RelA eller RelB alene er mere effektive til at øge transkriptionen af RelB-promotoren, end når den co-transficeres med p50, blev 1.1 kb-konstruktionen Co-transficeret med RelA eller RelB og/eller p50 cDNA til HeLa-celler. Som vist i figur 5c er RelA alene mere effektiv end RelA/p50 til at drive transkriptionen af 1.1 kb-genkonstruktionen, mens RelB alene er mindre effektiv end RelB/p50. Mens p50 således kan udøve en hæmmende virkning på promotoraktiviteten, når den udtrykkes med RelA, forårsager både RelA alene eller RelA/p50 stadig potent transaktivering af RelB-promotoren. Lignende resultater blev set med 0,25 kb-konstruktionen (data ikke vist). Alt i alt indikerer disse resultater, at 5′ RelB-regionen, klonet og karakteriseret, giver en basal transkriptionel aktivitet; det er inducerbart ved NF-kB inducerende stimuli, og endnu vigtigere er det lydhør over for RelA, c-Rel og RelB-udtryk.

baseret på disse resultater forsøgte vi næste gang at karakterisere de formodede cis-virkende sekvenser, der formidler enten RelA eller RelB-afhængig RelB-promotoraktivitet. Som vist i figur 4 er mindst to NF-kB cis-virkende motiver til stede umiddelbart opstrøms for den GC-rige region og transkriptionsinitieringsstederne og omtales vilkårligt her som kBI og kBII. Individuel mutation af disse steder inden for 1,1-og 0,25 kb-konstruktionen blev udført, og den transkriptionelle aktivitet blev analyseret som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 6a ophæver mutation af kBI og i højere grad kBII den TNF-eller PMA-inducerede transkriptionsaktivering af 0,25 kb RelB-promotorregionen. Hvis RelB–promotor-reporter-genet i stedet for at bruge eksogene stimuli Co–transficeres med ekspressionsvektorer af enten RelA eller RelB og p50, demonstreres det, at den transkriptionelle opregulering af RelB-promotorregionen af RelA eller RelB medieres gennem kBI eller kBII cis-virkende motiver.

figur 6

de formodede cis-virkende kB-steder, der er til stede i den humane RelB-promotor, formidler transaktivering af RelB-promotoren udløst af TNF, PMA, RelA og RelB. (- en) HeLa celler blev transficeret som i figur 5 med en NF-kB concatamer kørsel ekspression af firefly luciferase eller .25 kb RelB luciferase ekspressionsvektor (vægt) eller den samme ekspressionsvektor indeholdende mutationer i henholdsvis KB1-eller kB2-stederne KB1 eller kB2 mut) plus et tk-luc (Renilla) plasmid til kontrol for transfektion. Celler blev derefter stimuleret med TNF eller PMA som i figur 5. (B) samme som i (a) bortset fra at 0,25 kb vægt-eller KB1-mutant-eller kB2-mutantrelb-promotorer blev co-transficeret med ekspressionsvektorer af p50 og RelA eller p50 og RelB

aktivering af RelB-promotoren ved NF-kB er ikke celletypespecifik

for at undersøge, om RelB-promotoraktiveringen var celletypespecifik, transficerede vi forbigående promotorkonstruktionerne til Jurkat-celler (en human T-cellelinie) og BJAB-celler (en human B-cellelinie). I Jurkat-celler blev den transkriptionelle aktivitet af 1,1 kb og 0,25 kb RelB-luc-ekspressionsvektorerne øget efter TNF-og PMA-behandling såvel som efter den forbigående ekspression af RelA og RelB og i mindre grad af c-Rel (figur 7a). Desuden undertrykte mutation af kBI og i højere grad af det kbii cis-virkende motiv i 0,25 RelB-promotorforstærkerregionen dets transaktivering ved enten TNF eller PMA eller ved co-ekspression af RelA, RelB og c-Rel. Disse resultater opnået i Jurkat-celler bekræfter dem, der observeres i HeLa-celler (figur 6).

Figur 7

transaktiveringen af RelB-promotoren er ikke cellespecifik. (a) Jurkat T-celler blev transficeret med 1.1 kb eller 0.25 kb RelB promotor og stimuleret eller ej med TNF eller PMA eller co-transfekteret med P50, p52, RelA, RelB eller c-Rel ekspressionsvektorer som i figur 5 og analyseret som angivet i figur 5. (B) Jurkat T-celler blev behandlet og analyseret som i (A), bortset fra at reporteraktiviteten af 0,25 kb vægt-og KBI-og kbii mut RelB-promotorkonstruktionerne blev analyseret. (C) BJAB B-celler blev transficeret med 0,25 kb vægt eller kBI-eller kBII mut RelB-promotorgenet og stimuleret eller ej med LPS (5 liter / ml) i 6 timer

ved hjælp af en tredje cellelinie, BJAB, demonstreres det også, at LPS inducerede promotoraktiviteten af det humane RelB-gen og er afhængig af tilstedeværelsen af begge kB cis-virkende steder (figur 7c).

de KBI-og kbi-cis-virkende sekvenser, der er til stede i RelB-promotoren, binder NF-kB-proteiner med forskellig affinitet

for at undersøge, hvorfor kBII-cis-virkende er mere effektiv til at formidle transaktiveringen af RelB-promotoren ved hjælp af NF-kB-proteiner eller ved NF-kB-inducerende stimuli, testede vi, om hvert kB-cis-virkende motiv kan binde de forskellige NF-kB-proteinmedlemmer med forskellig affinitet, som foreslået af nylige undersøgelser (Menetski, 2000). For at løse dette udførte vi EMSA, hvor begge cis-virkende motiver blev sammenlignet. HeLa-celler blev transient transficeret med vektor alene eller ekspressionsvektorer for p50, RelA, RelB eller c-Rel og kombinationer. Nukleare ekstrakter fra disse transficerede celler blev derefter analyseret i EMSA ved hjælp af enten kBI eller kBII som prober. Som vist i figur 8a binder kBI p50 med større affinitet end kBII-stedet. Ligeledes binder det KBI cis-virkende motiv RelA med en lavere affinitet end kBII-motivet. I et gentaget forsøg blev sammensætningen af hvert proteinbindingskompleks yderligere analyseret ved anvendelse af antistoffer mod hver NF-kB-underenhed. Som vist i figur 8b er størstedelen af NF-kB-bindingen til kBI-motivet sammensat af p50-homodimerer og i mindre grad af P50/RelB og p50/c-Rel-komplekser. I modsætning hertil har kBII-motivet en højere affinitet mod P50/RelA eller p50 / RelB heterodimerer og RelA homodimerer. Disse forskelle fremhævet gennem EMSA-eksperimenter kan forklare den højere funktionelle relevans af kBII-motivet til formidling af den RelA-inducerede transaktivering af RelB-promotoraktiviteten.

figur 8

NF-kB-sted I og II i RelB-promotoren binder forskelligt NF-kB-homodimerer og heterodimerer. (a) HeLa-celler blev transficeret med vektorkontrol eller plasmider, der udtrykte p50 RelA, p50 og RelB eller c-Rel. Kerneekstrakter (5 liter) blev inkuberet med KBI-og KBII-DNA-prober mærket med 32P. Komplekserne blev analyseret af EMSA. (B) HeLa-celler blev transfekteret som i (A), og nukleare ekstrakter blev inkuberet med LARP-32P-mærkede BI-eller BII-DNA-prober i nærvær eller fravær af antistoffer, der er specifikke for p50, RelA, RelB eller c-Rel. Komplekserne blev analyseret af EMSA. Densitometri blev udført, og procentdelen af kompleks forskudt eller hæmmet fra dannelse af det specifikke antistof er indikeret. (c) humane perifere blodlymfocytter blev stimuleret eller ej med TNFa (10 ng/ml) i 20 minutter. Nukleare ekstrakter blev inkuberet med KBI-32P-mærkede KBI-eller kBII-DNA-prober i nærvær eller fravær af antistoffer, der er specifikke for p50 eller RelA. Komplekserne blev analyseret som ovenfor (B)

for at bestemme, hvilke NF-kB-proteiner fra primære celler der ville binde RelB-promotoren, udførte vi EMSA med nukleare ekstrakter fra humane perifere blodlymfocytter, der var blevet stimuleret eller ej med TNFa (figur 8c). I lighed med hela-transfektionsforsøgene (figur 8a,b) ser det dominerende kompleks fra NF-kB-komplekset til stede i kernerne fra ikke-stimuleret PBLs-binding til kBI-sonden ud til at være p50-homodimerer med meget lidt binding til kBII-sonden. Ved TNFa-stimulering øges bindingen til kBII-sonden imidlertid og består af P50/RelA heterodimerer, mens cirka 50% af komplekserne bundet til kBI sandsynligvis er P50-homodimerer. EMSA blev udført på disse ekstrakter under anvendelse af et antistof specifikt for RelB, og der blev ikke påvist nogen forskydning eller ændring i binding for nogen af proberne (data ikke vist). Disse resultater peger igen på vigtigheden af RelA i transaktivering af RelB-promotoren.

RelB driver p21-promotoraktivitet og øger ekspressionen af P21-proteinet

endelig undersøgte vi den potentielle relevans af RelB i onkogenese. NF-kB har været kendt for at forhindre programmeret celledød induceret af mange forskellige stimuli; specifikt har hæmning af NF-kB vist sig at forbedre antitumoreffekter ved hjælp af kemoterapeutika., 1999). Endvidere har NF-kB vist sig at spille en rolle i forebyggelsen af TNFa-induceret apoptose i tumorceller (Beg og Baltimore, 1996). Da p21 er et anti-apoptotisk molekyle, hvis opregulering kræver NF-kB i visse celletyper (Dotto, 2000; Javelaud et al., 2000; Pennington et al., 2001), spurgte vi, om RelB, et medlem af NF-kB-familien, spiller en rolle i at drive p21-udtryk. U937-celler, der inducerbart udtrykker HA-RelB, blev behandlet eller ej i 24 timer med cadmium for at inducere ekspression af et HA-RelB-transgen. Som det ses i figur 9a, fører induktion af HA-RelB til P21-proteinekspression. Dette blev observeret på en tids-og dosisafhængig måde (data ikke vist). Vi stillede derefter spørgsmålstegn ved, om denne RelB-drevne stigning i proteinekspression skyldtes transaktivering af RelB på p21-promotoren. HeLa celler blev transficeret med fuld længde p21 promotor luciferase construct, en minimal TK promotor kørsel Renilla luciferase, og RelB og p50 ekspressionsvektorer. Celler blev lyseret og målt for normaliseret firefly luciferase aktivitet. Som det ses i figur 9b fremmer ekspressionen af RelB og dens dimer-partner p50 transaktivering af p21-promotoren. Disse resultater giver således det første bevis for, at RelB kan regulere ekspressionen af ‘NF-kB-afhængige’ gener involveret i både cellecykluskontrol og i resistens over for apoptose og dermed onkogenese.

figur 9

RelB driver ekspressionen af P21-protein og p21-promotoraktivitet. (a) u937-celler udtrykte stabilt et cadmium-inducerbart HA-RelB-transgen. Celler blev behandlet med eller uden 90 liter cadmium i 24 timer for at inducere eller ikke HA-RelB, som angivet ovenfor figuren. 20 cytosoliske lysater af lutg blev udsat for SDS–PAGE. Membraner blev blottet med anti-HA og anti-p21 antistoffer. (B) HeLa-celler blev transficeret med 100 ng af en p21 promotor-firefly luciferase reporter-konstruktion i fuld længde og 50 ng af en TK-Renilla luciferase reporter-konstruktion med eller uden 100 ng RelB og 100 ng p50 cDNA. Celler blev lyseret, og luciferaseaktivitet blev bestemt ved luminescens. Aflæsninger udtrykkes i relative luciferase enheder (RLU) svarende til ekspression af firefly luciferase normaliseret til den konstitutivt udtrykte Renilla luciferase

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.