PRO-Seq

secvențiere nucleară de precizie

secvențierea nucleară de precizie (PRO-Seq) mapează site-urile de pauză RNAPII cu rezoluție de perechi de baze în timpul transcrierii ARN (Kwak și colab., 2013) (Mahat și colab., 2016). Această abordare este similară cu GRO-Seq, dar oferă avantajul suplimentar al Rezoluției cu o singură bază. Site-urile de inițiere RNAPII pot fi mapate folosind un protocol modificat numit PRO-cap. În PRO-seq, 4 Reacții de rulare separate, fiecare cu doar 1 tip de biotină-NTP și sarkosil, sunt efectuate pe lizați nucleari. Încorporarea biotinei unice-NTP oprește alungirea suplimentară a firelor ARN în curs de formare de către RNAPII. Firele de ARN sunt extrase, fragmentate și purificate prin streptavidin pull-down. Apoi, adaptoarele 3′ sunt ligate direct la proba purificată înainte de o altă etapă de purificare a streptavidinei. Capetele de 5′ sunt reparate folosind TAP și PNK înainte de a lega adaptoarele de 5′. Fragmentele de ARN flancate de adaptor sunt îmbogățite printr-un alt proces de extragere a streptavidinei înainte de amplificarea RT și PCR. Firele ADNc rezultate sunt secvențiate de la capătul 3′.

avantaje:

  • hărți rnapii site-uri de pauză cu rezoluție de perechi de baze
  • reacții de rulare Separate limitează adăugarea de nucleotide, altele decât cele furnizate biotină-NTP
  • etape Multiple de îmbogățire a biotinei înainte de PCR
  • site-urile de inițiere pot fi mapate folosind Pro-cap

dezavantaje:

  • imposibil de detectat complexele rnapii arestate sau retrase (Weber și colab., 2014)
  • limitat la reacții in vitro

reactivi:
Illumina library prep and array Kit Selector
recenzii:
Brent M. R. Blocaje rutiere anterioare și noi oportunități în cartografierea rețelei factorului de transcriere. Tendințe Genet. 2016; 32:736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M. și colab. Reglarea locală a expresiei genelor de către promotorii lncRNA, transcripția și îmbinarea. Natura. 2016;539:452-455

Wang I. X., Core L. J., Kwak H. și colab. Diferențele ARN-ADN sunt generate în celulele umane în câteva secunde după ce ARN-ul iese din polimeraza II. Cell Rep.2014;6:906-915
Danko C. G., Hyland S. L., Core L. J. și colab. Identificarea elementelor de reglementare transcripționale active din datele GRO-seq. Metode Nat. 2015;
Core L. J., Martins A. L., Danko C. G., Waters C. T., Siepel A. și Lis J. T. analiza ARN-ului născut identifică o arhitectură unificată a regiunilor de inițiere la promotorii și amplificatorii mamiferelor. Nat Genet. 2014;
Pagano J. M., Kwak H., Waters C. T. și colab. Definirea legării ARN NELF-e în regiunile de pauză HIV-1 și promotor-proximal. PLoS Genet. 2014; 10: e1004090

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.