Pro-Seq

sequenciamento nuclear de precisão

Precision nuclear run-on sequencing (PRO-Seq) mapeia locais de pausa RNAPII com resolução de pares de bases durante a transcrição de RNA (Kwak et al., 2013) (Mahat et al., 2016). Essa abordagem é semelhante ao GRO-Seq, mas fornece o benefício adicional da resolução de base única. Os sites de iniciação RNAPII podem ser mapeados usando um protocolo modificado chamado PRO-cap. No PRO-seq, 4 reações de execução separadas, cada uma com apenas 1 tipo de biotina-NTP e sarkosyl, são realizadas em lisados nucleares. A incorporação da única biotina-NTP interrompe o alongamento adicional de cadeias de RNA nascentes por RNAPII. As cadeias de RNA são extraídas, fragmentadas e purificadas através do pull-down de estreptavidina. Em seguida, os adaptadores 3 ‘ são ligados diretamente à amostra purificada antes de outra etapa de purificação de estreptavidina. As extremidades 5′ são reparadas usando TAP e PNK antes de ligar os adaptadores 5′. Os fragmentos de RNA flanqueados por adaptador são enriquecidos através de outro processo de pull-down de estreptavidina antes da amplificação RT e PCR. Os fios de cDNA resultantes são sequenciados a partir da extremidade 3’.

vantagens:

  • Mapas RNAPII pausa de sites com base de par de resolução
  • execução Separado em reações limite a adição de nucleotídeos outros do que a fornecida biotina-NTP
  • Vários biotina enriquecimento passos antes de PCR
  • Iniciação sites pode ser mapeada usando o PRO-cap

Desvantagens:

  • Incapaz de detectar preso ou recuado RNAPII complexos (Weber et al., 2014)
  • limitado a reações in vitro

reagentes:
Illumina Library Prep and Array Kit Selector
comentários:
Brent M. R. Bloqueios de estradas anteriores e novas oportunidades no mapeamento de rede do fator de transcrição. Tendências Genet. 2016; 32: 736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M., et al. Regulação Local da expressão gênica por promotores de lncRNA, transcrição e splicing. Natureza. 2016;539:452-455

Wang I. X., Core L. J., Kwak H., et al. As diferenças RNA-DNA são geradas em células humanas em segundos após a saída do RNA polimerase II. Cell Rep. 2014; 6: 906-915
Danko C. G., Hyland S. L., Core L. J., et al. Identificação de elementos regulatórios transcricionais ativos a partir de dados GRO-seq. Métodos Nat. 2015;
Core L. J., Martins A. L., Danko C. G., Waters C. T., Siepel A. and Lis J. T. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nat Genet. 2014;
Pagano J. M., Kwak H., Waters C. T., et al. Definição da ligação do RNA NELF-E nas regiões de pausa proximal do HIV-1 e do promotor. PLoS Genet. 2014; 10: e1004090

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