Pro-Seq

Precision Nuclear Run-on Sequencing

Precision nuclear run-on sequencing (PRO-Seq) kaarten RNAPII pauzeplaatsen met base-pair resolutie tijdens de transcriptie van RNA (Kwak et al., 2013) (Mahat et al., 2016). Deze benadering is gelijkaardig aan GRO-Seq, maar het verstrekt het toegevoegde voordeel van single-base resolutie. Rnapii initiatieplaatsen kunnen in kaart worden gebracht gebruikend een gewijzigd protocol genoemd Pro-cap. In PRO-seq worden 4 afzonderlijke run-on reacties, elk met slechts 1 type biotine-NTP en sarkosyl, uitgevoerd op nucleaire lysaten. De integratie van enige biotine-NTP stopt verdere verlenging van de bundels van ontluikende RNA door RNAPII. De bundels van RNA worden geëxtraheerd, gefragmenteerd, en gezuiverd door streptavidin pull-down. Vervolgens worden de 3 ‘ adapters direct aan de gezuiverde steekproef voor een andere stap van de streptavidinreiniging ligated. De 5 ‘einden worden gerepareerd met behulp van kraan en PNK voordat ligating 5′ adapters. De adapter-flanked fragmenten van RNA worden verrijkt door een ander streptavidin pull-down proces vóór RT en PCR versterking. De resulterende cDNA bundels worden gerangschikt van eind 3’.

voordelen:

  • Maps RNAPII pauzeerplaatsen met basepaarresolutie
  • afzonderlijke run-on reacties beperken de toevoeging van andere nucleotiden dan de meegeleverde biotine-NTP
  • meerdere stappen biotineverrijking vóór PCR
  • Initiatieplaatsen kunnen in kaart worden gebracht met behulp van PRO-cap

nadelen:

  • niet in staat om gearresteerd of backtracked rnapii complexen detecteren (Weber et al., 2014)
  • Limited to in vitro reactions

reagentia:
Illumina Library prep and Array Kit Selector
Reviews:
Brent M. R. Verleden wegversperringen en nieuwe kansen in transcriptiefactor netwerk Mapping. Trends Genet. 2016; 32: 736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M., et al. Lokale regulering van genexpressie door lncRNA-promotors, transcriptie en splicing. Natuur. 2016;539:452-455

Wang I. X., Core L. J., Kwak H., et al. RNA-DNA verschillen worden gegenereerd in menselijke cellen binnen seconden na RNA exits polymerase II. Cell Rep. 2014; 6: 906-915
Danko C. G., Hyland S. L., Core L. J., et al. Identificatie van actieve transcriptionele regelgevende elementen uit GRO-seq-gegevens. Nat Methoden. 2015;Core L. J., Martins A. L., Danko C. G., Waters C. T., Siepel A. and Lis J. T. Analysis of nascent RNA identificeert een unified architecture of initiation regions at mammalian promotors and enhancers. Nat Genet. Pagano J. M., Kwak H., Waters C. T., et al. Het definiëren van Nelf-e RNA binding in HIV-1 en promotor-proximale pauze regio ‘ s. PLoS Genet. 2014; 10: e1004090

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.