PRO-Seq

Sequenziamento nucleare di precisione

Il sequenziamento nucleare di precisione (PRO-Seq) mappa i siti di pausa RNAPII con risoluzione della coppia di basi durante la trascrizione dell’RNA (Kwak et al., 2013) (Mahat et al., 2016). Questo approccio è simile a GRO-Seq, ma fornisce il vantaggio aggiuntivo della risoluzione a base singola. I siti di iniziazione RNAPII possono essere mappati utilizzando un protocollo modificato denominato PRO-cap. In PRO-seq, 4 reazioni run-on separate, ciascuna con solo 1 tipo di biotina-NTP e sarkosyl, vengono eseguite su lisati nucleari. L’incorporazione del singolo biotina-NTP arresta l’ulteriore allungamento dei filamenti di RNA nascenti da parte di RNAPII. I filamenti di RNA vengono estratti, frammentati e purificati attraverso streptavidin pull-down. Successivamente, 3 ‘ adattatori sono legati direttamente al campione purificato prima di un’altra fase di purificazione streptavidina. Le estremità da 5 ‘vengono riparate utilizzando TAP e PNK prima di legare gli adattatori da 5′. I frammenti di RNA affiancati dall’adattatore sono arricchiti attraverso un altro processo di pull-down di streptavidina prima dell’amplificazione RT e PCR. I trefoli cDNA risultanti sono sequenziati dall’estremità 3’.

Vantaggi:

  • Mappe RNAPII sospensione di siti con base-coppia di risoluzione
  • Separato-reazioni limitare l’aggiunta di nucleotidi altro che la condizione di biotina-NTP
  • Più biotina arricchimento passaggi prima di PCR
  • siti di Iniziazione può essere mappato utilizzando PRO-cap

Svantaggi:

  • In grado di rilevare arrestati o sono tornati indietro RNAPII complessi (Weber et al., 2014)
  • Limitato alle reazioni in vitro

Reagenti:
Illumina Library prep and Array Kit Selector
Recensioni:
Brent M. R. Blocchi stradali del passato e nuove opportunità nella mappatura della rete dei fattori di trascrizione. Tendenze Genet. 2016; 32:736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M., et al. Regolazione locale dell’espressione genica da parte dei promotori lncRNA, trascrizione e splicing. Natura. 2016;539:452-455

Il suo nome deriva dal greco antico. Le differenze RNA-DNA sono generate nelle cellule umane in pochi secondi dopo che l’RNA esce dalla polimerasi II. Cell Rep. 2014; 6: 906-915
Danko CG, Hyland SL, Core LJ, et al. Identificazione degli elementi regolatori trascrizionali attivi dai dati GRO-seq. Metodi Nat. 2015;
Core LJ, Martins AL, Danko CG, Waters CT, Siepel A e Lis JT L’analisi dell’RNA nascente identifica un’architettura unificata delle regioni di iniziazione nei promotori e nei potenziatori dei mammiferi. Nat Genet. 2014;
Pagano JM, Kwak H., Waters CT, et al. Definizione del legame dell’RNA NELF-E nelle regioni di pausa dell’HIV-1 e del promotore-prossimale. PLoS Genet. 2014; 10:e1004090

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