PRO-Seq

Séquençage Nucléaire de précision

Le séquençage nucléaire de précision (PRO-Seq) cartographie les sites de pause RNAPII avec une résolution de paires de bases pendant la transcription de l’ARN (Kwak et al., 2013) (Mahat et coll., 2016). Cette approche est similaire à GRO-Seq, mais elle offre l’avantage supplémentaire d’une résolution à base unique. Les sites d’initiation RNAPII peuvent être cartographiés à l’aide d’un protocole modifié nommé PRO-cap. Dans PRO-seq, 4 réactions de rodage distinctes, chacune avec seulement 1 type de biotine – NTP et sarkosyl, sont effectuées sur des lysats nucléaires. L’incorporation de la biotine unique-NTP arrête l’allongement supplémentaire des brins d’ARN naissants par RNAPII. Les brins d’ARN sont extraits, fragmentés et purifiés par traction vers le bas de la streptavidine. Ensuite, des adaptateurs 3′ sont ligaturés directement sur l’échantillon purifié avant une autre étape de purification de la streptavidine. Les extrémités 5′ sont réparées à l’aide de TAP et de PNK avant de ligaturer les adaptateurs 5′. Les fragments d’ARN flanqués d’un adaptateur sont enrichis par un autre processus d’extraction de la streptavidine avant l’amplification par RT et PCR. Les brins d’ADNc résultants sont séquencés à partir de l’extrémité 3′.

Avantages:

  • Cartographie des sites de pause RNAPII avec une résolution de paire de bases
  • Des réactions d’amorçage distinctes limitent l’ajout de nucléotides autres que la biotine-NTP fournie
  • Plusieurs étapes d’enrichissement en biotine avant la PCR
  • Les sites d’initiation peuvent être cartographiés à l’aide de PRO-cap

Inconvénients:

  • Impossible de détecter les complexes de RNAPII arrêtés ou retracés (Weber et al., 2014)
  • Limité aux réactions in vitro

Réactifs :
Sélecteur de kit de préparation et de matrice Illumina Library
Avis:
Brent M. R. Obstacles passés et Nouvelles Opportunités dans la Cartographie des Réseaux de Facteurs de Transcription. Tendances Genet. 2016; 32:736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M., et al. Régulation locale de l’expression des gènes par les promoteurs de l’ARNL, transcription et épissage. Nature. 2016;539:452-455

Wang I. X., Core L. J., Kwak H., et al. Les différences ARN-ADN sont générées dans les cellules humaines quelques secondes après la sortie de l’ARN de la polymérase II. Cell Rep. 2014; 6:906-915
Danko C. G., Hyland S. L., Core L. J., et al. Identification des éléments de régulation transcriptionnelle actifs à partir des données GRO-seq. Méthodes Nat. 2015;
Core L. J., Martins A. L., Danko C. G., Waters C. T., Siepel A. et Lis J. T. L’analyse de l’ARN naissant identifie une architecture unifiée des régions d’initiation au niveau des promoteurs et des exhausteurs de mammifères. Nat Genet. 2014;
Pagano J. M., Kwak H., Waters C. T., et al. Définition de la liaison de l’ARN NELF-E dans les régions de pause du VIH-1 et du promoteur proximal. PLoS Genet. 2014; 10: e1004090

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