Rekombinaasipolymeraasivahvistus

RPA on yksi useista isotermisistä nukleiinihappovahvistustekniikoista, jotka on kehitettävä molekyylidiagnostiikkana ja joiden tavoitteena on usein yksinkertaistaa PCR: ään nähden tarvittavaa laboratoriolaitteistoa. Muita isotermisiä monistustekniikoita ovat muun muassa lamppu, NASBA, helikaasiriippuvainen monistusreaktio (HDA) ja nipistysentsyymien monistusreaktio (NEAR). Tekniikat eroavat erityispiirteet pohjamaali suunnittelu ja reaktio mekanismi, ja joissakin tapauksissa (kuten RPA) hyödyntää cocktaileja kahden tai useamman entsyymin. Kuten RPA, monet näistä tekniikoista tarjoavat nopeita vahvistusaikoja, joissa on mahdollista yksinkertaistaa instrumentointia, ja raportoitu resistenssi aineille puhdistamattomissa näytteissä, joiden tiedetään estävän PCR: ää. Vahvistusajan osalta nykyaikaiset lämpösyklerit, joissa on nopeat lämpötilarampit, voivat lyhentää PCR-vahvistusaikoja alle 30 minuuttiin, erityisesti lyhyille amplikoneille, jotka käyttävät kaksilämpötilaista pyöräilyä perinteisten kolmen lämpötilan protokollien sijaan. Lisäksi näytteen Prepin (mukaan lukien tarvittaessa DNA: n tai RNA: n analysointi ja uuttaminen) vaatimukset olisi otettava huomioon osana tekniikan kokonaisaikaa ja monimutkaisuutta. Vaatimukset vaihtelevat tekniikan sekä kohde-ja näytetyypin mukaan.

PCR: ään verrattuna RPA: n pohjamaalin ja koettimen suunnittelun ohjeet ovat vähemmän vakiintuneet, ja ne saattavat vaatia jonkin verran yritystä ja erehdystä, vaikka viimeaikaiset tulokset osoittavat, että myös tavalliset PCR-pohjustimet voivat toimia. Diskreetin amplikonin yleinen periaate, jota rajoittaa eteenpäin-ja taaksepäin suuntautuva pohjamaali, jossa on (valinnainen) sisäinen fluorogeeninen anturi, on samanlainen kuin PCR. PCR-alukkeita voidaan käyttää suoraan RPA: ssa, mutta niiden lyhyen pituuden vuoksi rekombinaationopeus on alhainen eikä RPA ole erityisen herkkä tai nopea. Tyypillisesti 30-38 emäsalusta tarvitaan tehokkaaseen rekombinaasifilamenttien muodostumiseen ja RPA: n suorituskykyyn. Tämä on toisin kuin joissakin muissa tekniikoissa, kuten lampuissa, joissa käytetään suurempaa määrää alukkeita, joihin liittyy ylimääräisiä suunnittelurajoituksia. Vaikka RPA: n alkuperäisessä vuoden 2006 raportissa kuvataan funktionaalinen reaktiokomponenttien joukko, TwistAmp-sarjan nykyinen (patentoitu) koostumus on ”olennaisesti erilainen” ja se on saatavilla vain TwistDx: n toimittajalta. Tämä on verrattuna PCR: n reaktioseoksiin, joita on saatavilla useilta toimittajilta, tai lamppuun tai NASBAAN, jolle reaktioseoksen koostumus on vapaasti julkaistu, jolloin tutkijat voivat luoda omia räätälöityjä ”sarjoja” edullisista raaka-aineista.

julkaistussa tieteellisessä kirjallisuudessa ei yleensä ole yksityiskohtaista vertailua isotermisten monistustekniikoiden, kuten RPA: n, HDA: n ja lampun, suorituskyvystä toisiinsa nähden, vaan usein verrataan yksittäistä isotermistä tekniikkaa ”gold standard” – PCR-määritykseen. Tämän vuoksi on vaikea arvioida näiden tekniikoiden ansioita riippumatta valmistajien, keksijöiden tai kannattajien väitteistä. Lisäksi minkä tahansa vahvistustekniikan suorituskykyominaisuuksia on vaikea erottaa pohjustustekniikasta: ”hyvä” pohjustussarja yhdelle RPA-kohteelle voi antaa nopeamman vahvistuksen tai herkemmän tunnistuksen kuin ”huono” lampun pohjustussarja samalle kohteelle, mutta päinvastainen voi pitää paikkansa eri pohjustussarjoissa eri kohteelle. Poikkeuksena on hiljattain tehty tutkimus, jossa verrattiin RT-qPCR: ää, RT-lamppua ja RPA: ta Schmallenberg-viruksen ja naudan virusripuliviruksen toteamiseksi.tutkimuksessa tuodaan tehokkaasti esiin, että kullakin vahvistustekniikalla on vahvuuksia ja heikkouksia, jotka voivat vaihdella kohteittain, ja että käytettävissä olevien vahvistustekniikoiden ominaisuudet on arvioitava yhdessä kutakin sovellusta koskevien vaatimusten kanssa. Kuten PCR: ssä ja missä tahansa muussa vahvistustekniikassa, julkaisuharha on ilmiselvästi olemassa, ja huonosti toimivia pohjustussarjoja pidetään harvoin raportoinnin arvoisina.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.