PRO-Seq

Precision Nuclear Run-on-sekvensointi

Precision nuclear run-on sequencing (PRO-Seq) maps RNAPII tauko sivustoja base-pari resoluutio aikana RNA transkriptio (Kwak et al., 2013) (Mahat et al., 2016). Tämä lähestymistapa on samanlainen kuin GRO-Seq, mutta se tarjoaa lisäetuna yhden pohjan resoluutio. RNAPII aloituspaikat voidaan kartoittaa muokatulla protokollalla nimeltä PRO-cap. PRO-seq: ssa suoritetaan 4 erillistä ajoreaktiota, joissa kussakin on vain 1 tyyppi biotiini-NTP ja sarkosyyli, ydinlysaateille. Yksittäisen biotiini-NTP: n liittäminen pysäyttää orastavien RNA-säikeiden pidentymisen rnapii: lla. RNA-säikeet uutetaan, pirstotaan ja puhdistetaan streptavidiinivedolla. Seuraavaksi 3 ’ – adapterit ligoidaan suoraan puhdistettuun näytteeseen ennen uutta streptavidiinin puhdistusvaihetta. 5 ’päät korjataan hana ja PNK ennen ligating 5’ adapterit. Adapterin reunustamat RNA-fragmentit rikastuvat toisella streptavidiinin vetoprosessilla ennen RT – ja PCR-monistusta. Tuloksena olevat cDNA-säikeet sekvensoidaan 3 ’ – lopusta.

edut:

  • kartat RNAPII pysähdyspaikat, joiden emäsparin erottelukyky
  • erilliset läpiajoreaktiot rajoittavat muiden nukleotidien kuin annetun biotiini-NTP: n lisäämistä
  • moninkertaisen biotiinin rikastuksen vaiheita ennen PCR: ää
  • aloituspaikat voidaan kartoittaa PRO-cap: n

haitat:

  • ei voida havaita pidätetty tai taaksepäin rnapii komplekseja (Weber et al., 2014)
  • Limited to in vitro reactions

Reagents:
Illumina Library prep and Array Kit Selector
Reviews:
Brent M. R. Aiemmat tiesulut ja uudet mahdollisuudet Transkriptiotekijäverkkokartoituksessa. Trendit Genet. 2016; 32: 736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M., et al. Lncrna: n promoottorit säätelevät geeniekspressiota, transkriptiota ja liittämistä. Luonto. 2016;539:452-455

Wang I. X., Core L. J., Kwak H., et al. RNA-DNA-erot syntyvät ihmissoluissa muutamassa sekunnissa sen jälkeen, kun RNA poistuu polymeraasi II:sta. Cell Rep. 2014;6: 906-915
Danko C. G., Hyland S. L., Core L. J., et al. Aktiivisten transkription säätelyelementtien tunnistaminen GRO-seq-tiedoista. Nat-Menetelmät. 2015;
Core L. J., Martins A. L., Danko C. G., Waters C. T., Siepel A. ja Lis J. T. orastavan RNA: n analyysi tunnistaa nisäkäspromoottorin ja tehostajan initiaatioalueiden yhtenäisen arkkitehtuurin. Nat Genet. 2014;
Pagano J. M., Kwak H., Waters C. T., et al. Määrittelen NELF-E-RNA: n sitoutumisen HIV-1: ssä ja promoottori-proksimaalinen tauko-alueilla. PLoS Genet. 2014; 10: e1004090

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.