PRO-Seq

Secuenciación Nuclear de Precisión

La secuenciación nuclear de precisión (PRO-Seq) mapea los sitios de pausa de RNAPII con resolución de par de bases durante la transcripción de ARN(Kwak et al., 2013) (Mahat et al., 2016). Este enfoque es similar a GRO-Seq, pero proporciona el beneficio adicional de una resolución de base única. Los sitios de iniciación de RNAPII se pueden mapear utilizando un protocolo modificado llamado PRO-cap. En PRO-seq, se llevan a cabo 4 reacciones continuas separadas, cada una con solo 1 tipo de biotina-NTP y sarkosil, en lisados nucleares. La incorporación de la biotina única-NTP detiene la elongación adicional de las hebras nacientes de ARN por RNAPII. Las hebras de ARN se extraen, fragmentan y purifican a través de la eliminación de estreptavidina. A continuación, los adaptadores de 3′ se ligan directamente a la muestra purificada antes de otro paso de purificación de estreptavidina. Los extremos de 5′ se reparan con TAP y PNK antes de ligar adaptadores de 5′. Los fragmentos de ARN flanqueados por el adaptador se enriquecen a través de otro proceso de extracción de estreptavidina antes de la amplificación de RT y PCR. Las hebras de ADNc resultantes se secuencian desde el extremo 3′.

Ventajas:

  • Mapea los sitios de pausa de RNAPII con resolución de par de bases
  • Reacciones de rodaje separadas limitan la adición de nucleótidos distintos de la biotina-NTP proporcionada
  • Múltiples pasos de enriquecimiento de biotina antes de la PCR
  • Los sitios de iniciación se pueden mapear utilizando PRO-cap

Desventajas:

  • Incapaz de detectar complejos RNAPII detenidos o retrotraídos (Weber et al., 2014)
  • Limitado a reacciones in vitro

Reactivos:
Selector de Kit de Preparación y arreglo de Biblioteca Illumina
Revisiones:
Brent M. R. Obstáculos Pasados y Nuevas Oportunidades en el Mapeo de Redes de Factores de Transcripción. Tendencias Genet. 2016; 32:736-750
Engreitz J. M., Haines J. E., Perez E. M., et al. Regulación local de la expresión génica por promotores de lncRNA, transcripción y empalme. Naturaleza. 2016;539:452-455

Wang I. X., Core L. J., Kwak H., et al. Las diferencias ARN-ADN se generan en células humanas en cuestión de segundos después de que el ARN sale de la polimerasa II. Cell Rep. 2014; 6: 906-915
Danko C. G., Hyland S.L., Core L. J., et al. Identificación de elementos reguladores transcripcionales activos a partir de datos GRO-seq. Métodos Nat. 2015;
Core L. J., Martins A. L., Danko C. G., Waters C. T., Siepel A. y Lis J. T. El análisis del ARN naciente identifica una arquitectura unificada de regiones de iniciación en promotores y potenciadores de mamíferos. Nat Genet. 2014;
Pagano J. M., Kwak H., Waters C. T., et al. Definición de la unión del ARN NELF-E en las regiones de pausa del VIH-1 y del promotor proximal. PLoS Genet. 2014; 10: e1004090

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