Amplifikace rekombinázové polymerázy

RPA je jednou z několika technik amplifikace izotermických nukleových kyselin, které mají být vyvinuty jako molekulární diagnostická technika, často s cílem zjednodušit laboratorní přístrojové vybavení požadované vzhledem k PCR. Částečný seznam dalších izotermických amplifikačních technik zahrnuje LAMP, NASBA, amplifikaci závislou na helicase (HDA) a nicking enzym amplification reaction (NEAR). Techniky se liší ve specifikách návrhu primeru a reakčního mechanismu a v některých případech (jako je RPA) využívají koktejly dvou nebo více enzymů. Jako RPA, mnoho z těchto technik nabízí rychlé amplifikační časy s potenciálem zjednodušené instrumentace, a hlášená odolnost vůči látkám v nečistých vzorcích, o nichž je známo, že inhibují PCR. S ohledem na dobu zesílení, moderní termocykly s rychlými teplotními rampami mohou zkrátit dobu zesílení PCR na méně než 30 minut, zejména pro krátké amplikony využívající spíše dvou-teplotní cyklování než konvenční tří-teplotní protokoly. Kromě toho by požadavky na přípravu vzorku (včetně lýzy a extrakce DNA nebo RNA, pokud je to nutné) měly být považovány za součást celkového času a složitosti vlastní technice. Tyto požadavky se liší podle techniky, konkrétního cíle a typu vzorku.

ve srovnání s PCR jsou pokyny pro návrh primerů a sond pro RPA méně zavedené a mohou mít určitý stupeň pokusů a omylů, i když nedávné výsledky naznačují, že standardní PCR primery mohou také fungovat. Obecný princip diskrétního amplikonu ohraničeného dopředným a reverzním primerem s (volitelnou) vnitřní fluorogenní sondou je podobný PCR. PCR primery mohou být použity přímo v RPA, ale jejich krátká délka znamená, že rychlost rekombinace je nízká a RPA nebude zvláště citlivá nebo rychlá. Typicky je zapotřebí 30-38 základních primerů pro efektivní tvorbu rekombinázových vláken a výkon RPA. To je na rozdíl od některých jiných technik, jako je lampa, které používají větší počet primerů podléhajících dodatečným konstrukčním omezením. Ačkoli původní zpráva RPA z roku 2006 popisuje funkční sadu reakčních složek, současná (proprietární) formulace soupravy TwistAmp je „podstatně odlišná“ a je k dispozici pouze od dodavatele TwistDx. To je ve srovnání s reakčními směsmi pro PCR, které jsou k dispozici od mnoha dodavatelů, nebo LAMP nebo NASBA, pro které je složení reakční směsi volně Publikováno, což vědcům umožňuje vytvářet vlastní přizpůsobené „soupravy“ z levných ingrediencí.

publikovaná vědecká literatura obecně postrádá podrobné srovnání výkonu izotermických amplifikačních technik, jako jsou RPA, HDA a lampa ve vztahu k sobě navzájem, často spíše porovnává jednu izotermickou techniku s“ zlatým standardem “ PCR test. To ztěžuje posuzování opodstatněnosti těchto technik nezávisle na tvrzeních výrobců, vynálezců nebo zastánců. Dále, výkonnostní charakteristiky jakékoli zesilovací techniky je obtížné oddělit od návrhu primeru: „dobrá“ sada primerů pro jeden cíl pro RPA může poskytnout rychlejší zesílení nebo citlivější detekci než“ špatná “ sada primerů pro stejný cíl, ale konverzace může platit pro různé sady primerů pro jiný cíl. Výjimkou je nedávná studie porovnávající RT-qPCR, RT-LAMP a RPA pro detekci Schmallenbergova viru a viru bovinního virového průjmu, což účinně poukazuje na to, že každá amplifikační technika má silné a slabé stránky, které se mohou lišit podle cíle, a že vlastnosti dostupných amplifikačních technik je třeba vyhodnotit v kombinaci s požadavky pro každou aplikaci. Stejně jako u PCR a jakékoli jiné techniky zesílení, zjevně existuje publikační zaujatost, se špatně fungujícími sadami primerů, které jsou zřídka považovány za hodné hlášení.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.